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如何体内进行心肌疾病相关基因的功能研究?这包含疾病模型的选择、基因转导病毒工具的选择、以及病毒注射方式的选择等几个关键问题。分述如下:

一、心肌功能研究常用的动物模型

1、在体动物模型(in vivo):

心肌相关研究模型包括:

① 心力衰竭——主动脉弓缩窄心衰模型(TAC),通过结扎冠状动脉前降支或前降支分支使主动脉口径缩小,以加重心脏后负荷, 在心肌肥厚模型形成后,可发展为心力衰竭。

② 心肌梗死——心肌缺血再灌注,心脏冠脉左前降支(LAD) 结扎使血管缺血一段时间,再松开使血液回流,造成再灌注二次损伤。

2、更新微信推送数据离体模型:Langendorff 心脏离体灌流模型

3、体外细胞模型:

① 细胞种类:新生鼠心肌细胞(1-3day);成年心肌细胞(Langendroff 分离,分离难度大,培养困难);H9C2 细胞系。

② 细胞造模:模拟缺血液,模拟缺氧环境。

汉恒心肌研究技术团队有完善的心肌细胞分离培养(包括新生和成年)经验。

具体造模方法详询599彩票。

二、心肌研究的病毒工具选择

目前主流的三大病毒载体:慢病毒、腺病毒、AAV(腺相关病毒)。对于心肌研究来说,AAV 病毒载体是最适合的研究工具。

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表 1. 心肌功能研究病毒工具比较

慢病毒:病毒滴度较低,较少用于动物活体实验;心脏不易被感染,因此不能用来感染心脏。

腺病毒:载体容量最大,可达 6kb,感染 3 天后即可观察;免疫原性高,必须原位注射才可以;分子较大,会被体内防御系统识别进而清除,因此表达周期只有 2~3 周。一般目的基因比较大,试验周期短,才会选择此种方法。

腺相关病毒:很小,易于扩散,具有均一性;这一特点也使得不易被免疫系统发现,免疫原性低,安全性高,能持续在体内表达 3~6 个月,具有长效性;而且可以选择特殊血清型 AAV1/6/9 感染,相对特异性强;可以直接静脉;主流杂志一致认可,可提高文章分值档次,大文章必备。

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图 1. 不同血清型 AAV 感染小鼠心脏组织。cTnT-EGFP 包装进 AAV 衣壳血清型 2,1,6,8,9 后分别通过颈静脉注射 1 周龄小鼠,4 周后检测小鼠心脏组织 EGFP 荧光(Gene Therapy. January,2011)。


汉恒心肌特异性 AAV --在体心肌的最佳基因载体

目前,AAV9 是公认的高效特异性靶向心脏表达的病毒载体血清型(图 1)。尽管 AAV8 的感染效果也不错,但是没有 AAV9 的扩散性好。无论是 AAV1/6/9 中的哪种血清型,都不能在心脏部位特异性表达。除了心脏外,AAV1 还可能在肌肉、骨骼肌、神经组织表达;AAV6 还可以在肺部表达;AAV9 还可以在肌肉、中枢神经、肺、肝脏表达。

汉恒心肌特异性 AAV,通过 AAV9,优选心肌特异性启动子和其他分子元件,实现心肌的高效基因转导:

① 高感染表达率:汉恒强启动子载体 AAV9,通过静脉注射,高效感染心肌,特异性上略差。

② 高心肌特异性 AAV:汉恒对 cTNT,cTNI,alpha-MHC,MLC2v 等启动子不同片段进行不同长短体的严筛,确定 cTNT 特异性启动子,高特异的表达与心脏。心脏中起始 cTNT 正常转录的元件较多,因此在心脏中相对表达量较其他部位高出很多。这里的表达是相对的,也就是说其他部位也可能会表达目的基因,但是跟心脏的表达量相比,可以忽略不计(图 2)。

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图 2. 心肌特异性启动子表达效果图小动物活体成像表明 cTNT 主要介导基因在心脏表达,虽然在肝脏中有些微渗漏。


③ 对实验要求极其严格(苛刻):载体含有 Cre 依赖的 DIO 元件。DIO 原件的载体只有在 Cre 动物模型中才会表达。因此,只需用心脏 Cre 敲入动物,含有 DIO 元件的载体便能在心脏特异表达。

三、病毒注射方式

对于心脏来说,慢病毒无法发挥作用;腺病毒能原位注射;而腺相关病毒适合原位注射和系统性注射,如尾静脉注射(带有特异性启动子)和眼眶静脉注射(带有特异性启动子)。

① 心肌原位注射:直接注射是通过注射器或类似装置直接注入心脏肌肉组织。该载体通过间质空间获得心肌细胞,并通过特定的载体机制进入,在转导方面更具地方性。有些实验要求特异性比较高,只能在心脏处观察,其他部位是不可以观察到病毒表达的。那么这种情况下我们建议大家采用原位多点注射方式。因为心肌细胞的分裂能力比较差,所以采用此种方式注射的病毒不会扩散到其他部位。但是这种方法有一个弊端,需要采用开膛手术,对操作者要求比较高,而且动物伤害性比较大(图 3)。

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图 3. 小鼠心脏原位病毒注射与效果示意图左图是通过开胸对心脏进行原位病毒注射。右图是原位注射 AAV-GFP 3 周后效果图。通常采取原位多点注射的方式。


② 尾静脉注射:从动物尾部的静脉注射病毒,以输送到心脏和整个循环,包括冠状循环。该载体通过心脏毛细血管网进入大多数心肌细胞,是最简单的一种注射方式(图 4)。

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图 4. 尾静脉注射 AAV 与心肌感染效果示意图

③眼眶静脉(temporal vein)注射:有些动物比较小,比如新生小鼠,尾静脉太细致使无法正常进行尾静脉注射。通过眼眶静脉注射同样可以传输到全身(图 5)。

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图 5. 眼眶静脉注射示意图

对于更小的动物,如新生鼠可以通过眼眶静脉注射。效果跟尾静脉类似。

此外,对于血管相关疾病如动脉粥样硬化、高血压等及其引发的内皮损伤等功能研究通常也可以通过 AAV 来实现。如血管外膜 AAV 基因转导(图 6)。

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图 6. 血管外膜 AAV 基因转导方法

血管剥离,然后用 matrigel 包裹,并涂抹适量 AAV 使之扩散感染到血管外膜。图中结果表明 AAV5 效果较好。对于血管内皮则不适用这一方法。

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